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兽药评审中心发布兽药急性毒性试验(LD50测定)指导原则

2024-06-19 14:37

兽药急性毒性试验(LD50测定)指导原则

一、概述

(一)定义与目的

急性毒性试验是指一日内对动物单次或多次给药,连续观察给药后动物产生的毒性反应及死亡情况的试验方法。经口(注射)一次性或24h内多次给予受试物后,在短时间内观察实验动物所产生的毒性反应,引起半数致死的剂量称为半数致死剂量,通常用LD50表示。这是评价兽药急性毒性的常用方法。

为了确保急性毒性试验(LD50测定)结果的真实性、可靠性和可追溯性,根据新兽药研究的规律,结合国内兽药毒理学评价的实际情况制定了本指导原则。

(二)适用范围

本指导原则适用于兽用化学药品、中兽药、消毒剂及饲料药物添加剂的急性毒性作用测定。

二、试验设计

(一)材料与方法

1.实验动物

采用两种性别的初成年小鼠/大鼠进行试验。小鼠体重为1822g,大鼠体重为180220g。动物购买后环境适应饲养35天。

2.受试药物及配制

1)申报兽药的原料或制剂  应为与其他试验同一批号的产品。

2)受试物溶液配制  一般采用水或食用植物油(如玉米油、花生油、橄榄油等)配制受试物溶液。可考虑用吐温-80作为助溶剂,或用羧甲基纤维素钠、明胶、淀粉等配制成混悬液,不能作成混悬液时,可制备成其它型式(如糊状物等)。必要时可选用二甲基亚砜溶解受试物,但不能采用具有明显毒性的有机溶剂。如采用未知毒性的溶剂应设对照组观察。

3.受试药物给药方法

    按受试药物检测要求经口或注射给药。一般一次性给予受试药物。如估计受试物的毒性很低或溶解度很低,可一日内多次给予,每次间隔23h,仍合并为一次剂量计算。若总剂量达到5000mg/kg仍不引起动物死亡时,即停止更多次的给予。

     给予受试物体积要求小鼠为0.10.2mL/10g体重,大鼠为0.51.0 mL/100 g体重。经口给予受试物,动物应隔夜空腹进行(一般禁食812h左右,不限制饮水)。

(二)试验步骤

1.预试验

每组设4只实验动物(雌、雄各半),拟定高剂量组剂量,再按35的倍数递减设定若干剂量组,依次进行试验,找出4/4致死剂量和0/4致死剂量。

如果高剂量组已达5000mg/kg的剂量,实验动物死亡率为0/4,并且将动物数增至10只(雌、雄各半),并重复两次试验动物均未出现死亡,则可结束整个急性毒性试验,急性毒性试验(LD50测定)结论为:受试物LD50大于5000mg/kg

2.正式试验

一般设57个剂量组。根据预备试验获得的4/4致死剂量(b0/4致死剂量(a的比值来确定正式试验组数(N;比值为23时,设45组;比值为310时,设57组;比值大于10时,设7组。

按下列公式求得相邻两组剂量比值(r

                    r = log-1

    以预试验获得的4/4致死剂量(b作为正式试验高剂量组(第一组)的剂量,按r值等比求得其它各剂量组的剂量。

1)实验动物称重、标记编号和分组

雄、雌动物分开进行正式试验,每组不小于10只动物。分别对雄、雌动物进行编号标记及称重,按设计试验组数(N对实验动物进行分组。分组采用完全随机法。

2)受试药物溶液配制

“1K系列稀释法等容量配制各剂量组所需的受试药物溶液,根据设计的试验剂量,按试验动物给予受试药物的体积要求,首先确定最大剂量组(如第一组)所需配制的受试药物溶液浓度C1以及各剂量组所需受试药物溶液的体积v

受试药物母液应配制的浓度C=C1,应配制的体积VmL)按下列公式计算:

V=(其中K=

根据母液浓度及体积计算需称取的受试药物量(mgmL)。

称取受试药物,置烧杯内,加入选定的溶剂溶解或稀释,转入容量瓶内,充分混匀并定容,即获得浓度C=C1的受试物母液。从中取出供最大剂量组(如第一组)给药用的溶液体积v,向原溶液中加入同体积的溶剂,混匀后溶液浓度为C1×K,正好是第二组所要求的剂量浓度C2;从中取出供第二组给药用的溶液体积v,再加入同体积的溶剂,混匀后溶液浓度为C2×K,正好是第三组所要求的剂量浓度C3。依此类推,配制得到各剂量组所需浓度及体积的受试药物溶液。

3)给药方法

按实验动物经口(注射)给予受试药物的体积要求,根据各实验动物的体重,计算各实验动物给予的受试药物体积。

按要求保定实验动物进行灌胃或注射给药。如在给药过程中因挤压、呛肺等造成死亡,需及时补足每组的动物数量。

4)试验观察

实验动物给药后一般观察7天,若给药4天后继续有死亡的,则需观察14天,必要时可延长观察至28天。认真观察实验动物中毒的发生、发展过程(观察项目见6.1),获取中毒特点及毒作用特征,对死亡动物需进行解剖,观察其中毒病理变化,并作好记录。

(三)数据整理

当雄性和雌性实验动物对受试药物反应差异显著时,应分别对其试验数据进行整理,计算各自的半数致死量(LD50);性别差异不显著,则将雄性和雌性实验动物的试验数据集中整理,统一计算分析。

根据试验记录,整理获得下表中的各项数据。

 

 

组别

动物数(n

给药剂量

mg/kgmL/kg

剂量对数

x

死亡动物数

r

死亡率

p

存活率

q

p·q









……








 

半数致死量(LD50)计算方法:

将试验获得的各项数值代入下列公式

LD50=lg-1                            

Sx50=                                                  

LD5095%可信限= lg-1lgLD50±1.96×Sx50                       

式中:

  Xm —— 最大剂量的对数值;

        i —— 组距,即相邻两组剂量对数值之差;

        p —— 各剂量组死亡率(以小数表示);

        q —— 各剂量组存活率,q =1-p

—— 各剂量组死亡率之和;

n  —— 各组动物数;

Sx50 —— lgLD50的标准误差

(四)结果评定

根据实验动物给药后中毒症状出现的时间、症状表现、死亡出现时间、尸体解剖病理变化及半数致死量(LD50),参照表3-2化学物急性毒性(LD50)剂量分级表,对受试药物进行评定。评定内容包括:

受试物主要中毒症状表现;

受试物半数致死量(LD50)及其95%可信限(单位mg/kg);

受试物毒性分级;

(五)注意事项

1.本指导原则仅对寇氏(korbor)法的技术环节及要求进行了规定,采用其它方法进行急性毒性试验需参照国家标准GB 15193.3-2003的相关内容进行。

2.除特别注明外,试验用水为蒸馏水,试剂为分析纯试剂,动物为SPF级实验动物。

3.实验动物饲养环境要求达到SPF级。

三、试验报告

为公正、科学地评价药物的毒性,对试验报告内容做如下要求:

1.试验目的。

2.试验时间与地点。

3.试验设计者、负责人、参加者及电子邮箱。

4.受试药物需注明兽药名称、生产厂家、规格、生产批号及用法与用量。

5.试验动物的品种与品系、体重、日龄或月龄、健康状况、检疫情况等

6.归纳总结该药物的试验结果,确受试药物的LD50和并对其急性毒性进行评定等

7.参考文献

8.试验数据,应有详细的试验原始记录。原始资料保存处、联系人、电话。

9.试验单位(加盖公章)。

四、附录及说明

附表4-1  啮齿动物中毒表现观察项目

器官系统

观察及检查项目

中毒后一般表现

中枢神经系统及

躯体运动

行为

改变姿势,叫声异常,不安,呆滞

动作

震颤,运动失调,麻痹,惊厥,强直性动作

各种刺激的反映

易兴奋,知觉过敏或缺乏知觉

大脑及脊髓反射

减弱或消失

肌肉张力

强直或弛缓

自主神经系统

瞳孔大小

缩小或放大

分泌

流涎,流泪

呼吸系统

鼻孔

流鼻涕

呼吸性质和速率

徐缓,困难,潮式呼吸

心血管系统

心区触诊

心动过缓,心律不齐,心跳过强或过弱

胃肠系统

腹形

气胀或收缩,腹泻或便秘

粪便硬度和颜色

粪便不成形,黑色或灰色

生殖泌尿系统

阴户,乳腺

膨胀

阴茎

脱垂

会阴部

污秽

皮肤和被毛

颜色,张力

发红,皱褶,松弛,皮疹

完整性

竖毛

粘膜

粘膜

流粘液,充血,出血性紫绀,苍白

口腔

溃疡

眼睑

上睑下垂

眼球

眼球突出或震颤

透明度

混浊

其他

直肠或皮肤温度

降低或升高

一般情况

姿势不正常,消瘦

 

附表4-2  化学物急性毒性(LD50)剂量分级表

级别

大鼠口服LD50/mg/kg

相当于人的致死量(g/人)

极毒

1

0.05

剧毒

150

0.5

中等毒

51500

5

低毒

5015000

50

实际无毒

500115000

500

无毒

15000

2500

 


来源:兽药评审中心

原文下载:

兽药急性毒性试验(LD50测定)指导原则.docx


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